使用切向流过滤进行胞外囊泡（外泌体）的纯化

在2019年出版的《Target Identification and Validation in Drug Discovery: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology》一书中包含了题为“Tangential Flow Filtration with or Without Subsequent Bind-Elute Size Exclusion Chromatography for Purification of Extracellular Vesicles”的章节。该章节详细介绍了使用切向流过滤进行胞外囊泡，特别是外泌体，的纯化步骤。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介

近几年来，随着一系列突破性文章的发表，胞外囊泡（EV）越来越受到关注。大部分体内细胞都会分泌EV，且在所有的体液中都可以检测到。EV可分为3个主要的亚群：来自内溶酶体途径的外泌体，直径约30-150nm；细胞质膜直接出芽形成的微泡，直径100-1000nm；以及源自凋亡细胞的凋亡小体，其非均质性较高，粒径范围500-5000nm。本文中的EV指外泌体和微泡。EV包含生物活性脂质、蛋白质和不同的RNA物质（如miRNA、mRNA和rRNA）。由于其较高的内容物异质性，其可以多效性的方式影响细胞，如直接与细胞表面受体相互作用、递送生物活性RNA和蛋白质及随后通过不同的机制，影响受体细胞的表型。

但是，治疗性和生物标记物EV研究都受到了缺乏严格纯化方案的限制。该领域的金标准是超速离心（UC），包括转速逐步提高的多个连续离心步骤，最后一步为110,00-120,000g UC。但是，针对这种方式有诸多的顾虑，包括产量高度依赖于操作员的水平、可能导致囊泡破碎和聚集、可放大性较低且可获得的纯度水平有限。因此，研究人员又开发了不同的纯化方法，包括微流、基于沉淀的技术、体积排阻层析（SEC）以及基于免疫捕获的技术。本文中，研究人员开发一种基于切向流过滤的可放大且稳健的纯化方法（TFF），其后续可选择性进行结合-洗脱的体积排阻层析（TFF/BE-SEC）。TFF/BE-SEC针对细胞培养上清液进行优化，程序可获得50-80%的高EV产量。该方法高度适合处理大体积的料液，获得可供后续临床前以及潜在临床使用的高纯度样品。

操作

细胞培养操作请参考原文。

切向流过滤材料：

• 100kD 中空纤维过滤器（MidiKros 65cm 100kDa mPES 0.5mm FLL x FLL，产品编号：D06-E100-05-N）。

• 300kD 中空纤维过滤器（MidiKros 65cm 300kD mPES 0.5mm FLL x FLL，产品编号：D06-E30-05-N）。

• 100kD 中空纤维过滤器（MidiKros 20cm² 100kDa mPES，产品编号：C02-E100-05-N）。

• 300kD 中空纤维过滤器（MicroKros 20cm² 300kD mPES，产品编号：C02-E300-05-N）。

• KrosFlo KR2i 切向流过滤器系统及自动背压阀，配用#16管路。

从细胞培养上清液中分离EV

1. 使用0.22μm孔径过滤器过滤样品，去除较大的颗粒。100mL以下样品可使用针头式过滤器，100mL以上样品可使用真空抽滤瓶。

2. 过滤后的细胞培养液可用于TFF过滤。在下面的步骤中，TFF系统使用KR2i TFF系统，配用300kD改性聚醚砜中空纤维过滤器（MidiKros 膜表面积370cm²）（备注1）。在下面所有TFF步骤中，流速设置为100mL/min，跨膜压设置为3.0psi（在润洗、样品运行和漂洗中，跨膜压不应超过3.0psi），剪切设置为3700S^-1。

3. 启动系统（启动系统前，确认所有的阀门打开，以使系统校准压力）。检查废液阀打开，容器和管路连接到系统。将废液管路连接到废液容器。背压阀用于“TMP”控制。

4. 中空纤维柱如以20%的甘油保存。上样前，逆时针反转泵方向，去除柱内的液体（编者注：中空纤维柱一般推荐以NaOH溶液保存）。

5. 将泵方向反转回顺时针方向，开始润洗。

6. 先用250mL Milli-Q水润洗柱子，之后再用500mL 经过滤的1X PBS溶液或所选择的缓冲液润洗。液流方向为顺时针方向，流速设置为100mL/min，最大跨膜压设置为3.0psi。

7. 润洗后，逆时针反转泵，去除柱内的液体。

8. 将泵重置为顺时针方向，上样，并以100mL/min的流速运行（跨膜压设置为3.0pai，剪切为3700S^-1）（备注2）。

9. 建议：以起始体积至少2倍体积的0.01M PBS或相似的所选缓冲液洗滤样品，以去除蛋白质杂质，并同时置换缓冲液。

10. 将样品浓缩至约5mL。

11. 逆时针反转液流，回收中空纤维柱和管路内的样品（速度100mL/min，压力3psi）。最终体积约为35mL（根据所用的中空纤维柱尺寸和管路长度优化）。

12. 建议：为进一步提高收率，使用5-10mL经0.22μm过滤器过滤的0.01M PBS，顺时针冲洗管路，以回收管路内可能残留的样品。所以，经浓缩、洗滤、回收以及二次回收步骤后，最终的总体积约为40-50mL（备注3-5）。

13. 如果需要更高的纯度，将洗滤/浓缩后的样品上样至混合模式（结合-洗脱/体积排阻）层析柱，如已达到纯度要求，直接进行最终的浓缩步骤。

中空纤维柱漂洗

1. 冲洗容器，装入250mL Milli-Q水，以100mL/min的流速运行系统（跨膜压3.0psi，剪切3700S^-1）。容器内的水运行完后，逆时针反转泵方向，去除柱子内剩余的液体。

2. 容器内装入250mL 0.1M NaOH，以与上一步相同的设置，顺时针运行系统。当容器内的体积约剩下一半时，关闭滤出阀，使缓冲液循环约5-10min。随后，打开滤液阀，直到所有液体滤出。逆时针反转泵，去除柱子内剩余的液体。

3. 冲洗容器，装入1L Milli-Q水，以与上一步相同的设置运行系统。水漂洗结束后，逆时针反转泵，去除柱子内剩余的液体。

4. 柱子保存在20%甘油中，短时间可置于室温条件下，长时间保存置于4℃（2周以上）。容器内装入100mL 20%甘油，泵入系统，然后关闭滤出阀，使柱子内完整充满液体。（编者注：中空纤维柱一般推荐以NaOH溶液保存）。

5. 5min后，停止运行。

6. 冲洗容器，如果已使用结束，断开进样管路，用Milli-Q水润洗。去除滤出废液，打开自动背压阀，关闭TFF系统。

结合-洗脱/体积排阻层析请参考原文

最终浓缩步骤

浓缩样品可以使用TFF过滤器（100kD，C02-E100-05-N或300kD，C02-E300-05-N）（备注6-9）。

1. 将50mL注射器连接到TFF中空纤维柱。如下图所示。

1. 在一端连接1个空的50mL注射器。在1个侧面端口连接另一个50mL注射器（滤液端口）。使用连接至柱子另一端（样品/缓冲液端口）的含有20-30mL 经过滤0.01 M PBS的50mL注射器润洗TFF柱子，将缓冲液温和地推入柱子，并使用另一端的注射器，使液体在柱子内流动，直到滤液注射器内收集到20-30mL液体。

2. 将装有样品的50mL注射器连接到样品端口。

3. 使用两端的注射器，使样品在柱子内流动，直到样品浓缩至1-2mL，用注射器吸出柱子内残留的样品。

4. 纯化的EV可储存或立即用于后续的实验。

5. 可选操作：从柱子一端打入5-10mL PBS，冲洗柱子，以冲出柱子内残留的EV。

TFF中空纤维柱漂洗

1. 在中空纤维柱上连接干净的50mL注射器。

2. 向连接到样品端口的注射器内装入50mL Milli-Q水，推入中空纤维柱，并通过另一端的注射器，使液体在柱子内来回流动。继续操作，直到所有的液体进入滤液侧注射器。注意，推的时候不要太用力，以免损坏膜。

3. 以相同的方式，用50mL 0.1M NaOH漂洗柱子。

4. 以相同的方式，用100mL Milli-Q水彻底冲洗柱子。

5. 向注射器内装入20mL 20%甘油，来回推动数次。

6. 取下注射器，关闭两端和侧面端口的阀。4℃储存，以备后续使用。

备注：

1. TFF步骤也可以使用100kD过滤器，此时，更多的蛋白质会被截留在样品中。100和300kD过滤器的EV收率均可达到将近100%。

2. 不同膜表面积的中空纤维柱设计用于不同的过滤体积。如300kD 的MidiKros中空纤维柱适用于100mL – 3L体积，而300kD的MicroKros适用于1-100mL样品体积。

3. 为比较TFF前后的纳米颗粒状况，可保存100-1000μL的培养液，以使用纳米颗粒示踪分析进行检测。

4. 如有需要，可在TFF之后停止，将样品保存在4℃过滤，之后再进行进一步的下游操作。

5. TFF过滤器一般一次性使用。但是，过滤器可在漂洗后重复使用。如果过滤器重复使用，需要周期性检测过滤器的性能，如果实验中EV损失过高或最终产物中截留的蛋白量过高，应废弃过滤器，

6. 推荐使用100kD TFF过滤器，因为所有的蛋白质和碎片可在更早的步骤去除，这一步仅用于浓缩颗粒。

7. 记住，注射器推动要温和，以免损坏柱子。

8. 如果所需的体积大于1-2mL，该步操作可以使用TFF系统，使用注射器只是为了降低死体积。

9. 在最终的浓缩步骤中，PBS可置换成其它适合的EV储存或适合下游分析的缓冲液；所以，这一步也可以作为最终的缓冲液置换步骤。

 本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：J.Z.Nordin, R.B.Bostancioglu, G.Corso, et al., Tangential Flow Filtration with or Without Subsequent Bind-Elute Size Exclusion Chromatography for Purification of Extracellular Vesicles. Target Identification and Validation in Drug Discovery: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2019,  https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9145-7_18.

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